模基生物豬小腸類器官培養(yǎng)基套裝

產(chǎn)品描述

    廈門?；?/span>豬小腸類器官培養(yǎng)基套裝是一款用于建立和維持豬小腸干細胞來源類器官的完全培養(yǎng)基。生長在該完全培養(yǎng)基中的豬小腸類器官主要由腸干細胞、腸祖細胞和腸絨毛細胞、潘氏細胞、 杯狀細胞和少量腸內(nèi)分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細胞類型和功能方面，豬小腸類器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征，因此是腸道體外研究的理想體外模型。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

ABW &模基生物基質(zhì)膠

組織消化液

上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

豬小腸類器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術(shù)配制豬小腸類器官完全培養(yǎng)基。以下是準備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整

用量。

1.冰上解凍 Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和 Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意： 解凍后，建議將Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和 Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x)

分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2. 將 200uLPorcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40uL Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至

9.76mL Porcine Intestinal Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 豬小腸類器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的豬小腸類器官完全培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內(nèi)使用。Porcine Intestinal Organoid Supplement

B(50x)內(nèi)含有細菌及真菌抗生素(50x)。

豬小腸類器官原代培養(yǎng) 

1. 依據(jù)所在單位批準的實驗動物倫理及操作規(guī)范進行動物組織取材，取材后的組織須在 2 - 8℃組織保存液或DPBS 中迅速轉(zhuǎn)運至潔凈實驗室進行組織處理和干細胞分離。

2. 準備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的 DPBS 備用。

3. 標準手術(shù)操作分離豬腸組織，根據(jù)實驗需求取總長度 1 - 10 cm 的小腸段，置于含 DPBS 的培養(yǎng)皿中。

4. 于生物安全柜中使用移液管將小腸一端注入 DPBS 以沖洗腸內(nèi)容物，沖洗后置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中，反

復(fù)沖洗數(shù)次至內(nèi)容物完全被沖洗干凈，置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中。

5. 使用手術(shù)剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手持手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手持手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表

面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗一次。

6. 將清洗后的小腸組織剪碎至約 2 mm 長寬，并轉(zhuǎn)移至 5 - 10 mL 含有 2 mM EDTA 的預(yù)冷 DPBS 中消化，4℃孵

育 30 min。

7. 消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)一次以去除 EDTA。

8. 用 5 mL 移液管在含冷的 DPBS 的培養(yǎng)皿或 50 mL 離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管尖以產(chǎn)生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打并

將吹打后的組織懸液通過 70 μm 濾器過濾。

9. 收集濾液，300×g，4℃離心 3 min。

10. 棄上清，使用 1 mL DPBS 重懸組織沉淀，取 20 μL 懸液進行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量

的懸液，300×g，4℃離心 3 min，棄上清后置于冰上預(yù)冷。

11. 用適量的?；飳Ｓ妙惼鞴倩|(zhì)膠重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每 25 μL 基質(zhì)膠懸液包含 100 - 500 個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

12. 將基質(zhì)膠和組織細胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入 24 孔板，25 μL 每孔滴加在孔底中心，避免懸

液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

13. 將接種完成后的培養(yǎng)板置于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

14. 提前配制豬小腸類器官完全培養(yǎng)基。

注意：原代或細胞分選后的類器官建立，需要在前 2 d 的培養(yǎng)體系中加入 10 μM 的二氫氯化物。

15. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預(yù)熱的豬小腸類器官完全培養(yǎng)基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無菌

水，置于 37℃溫箱、5% CO₂條件下培養(yǎng)。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

16. 每 3 d 更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應(yīng)避免破壞基質(zhì)膠。

17. 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下應(yīng)在 5 - 7 d 內(nèi)建成。

豬小腸類器官傳代培養(yǎng)

1. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過潤洗液潤洗的 1.5 mL EP 管中。

2. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3. 300×g，4℃離心 3 min，棄上清，用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭加入 200 μL 類器官消化液并充分混勻，37℃條件下消化 1 - 3 min，消化結(jié)束后加入 1 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻。

4. 300×g，4℃離心 3 min，棄上清，再次加入 1 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基并混勻。

5. 300×g，4℃再次離心 3min，棄上清后置于冰上。

6. 用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30 μL 左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

9. 配制豬小腸類器官完全培養(yǎng)基。

10. 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿孔壁加入提前預(yù)熱的豬小腸類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500 μL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出新的類器官之后可進行后續(xù)實驗。